1.动物的选择与超数排卵选用供卵猪和供胚猪;二者均已性成熟,体重为100―140千克。

每日7:00―8:00时与14:00-15:00时两次检查发情情况,记录。然后实施超排处理。

采用PMSG/hCG法进行超排,肌注PMSG750-1000IU,诱导卵泡发育;72h后,肌注500-1000IUhCG,诱导排卵。于注射hCG后40―49h,收集卵母细胞。

胚胎供体则在注射hCG后24h和48h交配两次。妊娠第2天取4细胞胚胎。

2.卵母细胞和胚胎的收集

(1)体内卵母细胞和胚胎的收集经手术或母猪收集卵母细胞或胚胎。

①静注安定注射液14mL。、12mL。手术过程中,视状态肌注846或用熏,手后视情况注射强心剂或苏醒灵。

②手术以常规手术法在中线或兼部开刀,暴露卵巢、输卵管和子宫。

③冲卵(胚)冲洗方法是从输卵管伞口冲向子宫―输卵管结合部。从输卵管伞口插入钝的注射针头,缓缓推压注射器使30-40ml冲卵液(杜氏PBS+2FCS)注入,慢慢从子宫角收集流出的液体。

在母猪冲卵时,于杀猪放血后立即取出输卵管或子宫,用盛有生理盐水的保温杯带回实验室。在26―28℃室内,用冲卵液冲洗输卵管和子宫,收集卵母细胞或胚胎。如卵外有卵丘细胞,则经含300μg/ml透明质酸酶的PBS处理几分钟,去除卵丘细胞,洗涤后备用。

(2)体外成熟卵母细胞的获得体外成熟的猪卵母细胞的培养方法见上述体外受精的内容。培养成熟后,去除卵丘细胞,选择形态良好并有第一极体的卵母细胞作为核移植的受体胞质。

3.胚胎细胞核移植

(1)胚胎卵裂球解离将胚胎(一般为桑椹胚阶段前的胚胎)置入含1%胰蛋白酶的无蛋白的Hank’s液中作用30s,去除透明带。再将无透明带的胚胎转入Hank’s+10%FCS中37℃培养10min,然后用吸管轻轻吹打,使胚胎解离成游离的卵裂球。

(2)细胞核移植

①卵母细胞及游离的卵裂球均置入操作液滴中。

用固定吸管吸住卵母细胞极体对侧的胞质,调整注射吸管使之与固定管处于同一水平。将注射管轻轻刺入透明带,使其轻轻抵在质膜上,抽吸出第一极体及其下的内容物,轻轻把注射管连同内容物拉出透明带外,完成去核。

②用注射管吸入一个供核的卵裂球,沿去核时的孔插入,缓缓将卵裂球放出,然后松开固定管。

③操作完毕后,将注核胚洗3次,在培养滴中培养30min,然后进行电融合。

4.电融合先把注核胚转移入0.3mol/L甘露醇融合液中平衡2min后,再移入电极间的融合液中。首先进行交流定位,交流脉冲为5V,5―10s;然后,用120V/mm、30μs的直流脉冲刺激一次。最后,将电激后的胚胎移入培养液中,在39℃培养30min,检查融合结果。

5.移核胚体外培养在39℃,5%CO2,95%空气和100%相对湿度的二氧化碳培养箱中培养4―4.5天,观察并记录其发育情况。

6.胚胎移植及手术方法基本同冲卵(胚)操作。受体母猪的发情期与供卵猪同步。其他见体外受精内容。

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